当您刚毕业并进入工作时，与一堆名词面对的实时定量PCR实验接触，您是否对从哪里开始感到困惑？ 放大曲线，标准曲线，阈值，CT值，熔解曲线和基线的含义是什么？ 那些实验的荧光图像太亮了，但我似乎无法识别它们。 今天，云顶国际·(中国)唯一官方网站将带您分两个部分学习这些知识和概念：专业术语和常见问题。

第一部分专业条款

1.扩增曲线

放大曲线是指曲线，其中循环数为横坐标和反应期间的实时荧光强度为PCR过程中的纵坐标。

2.基线

基线指的是，在PCR扩增反应的前几个周期中，荧光信号几乎没有变化。 信号级别显示接近直线，这种直线是基线。

3.荧光阈值设置

 通常，PCR反应的前15个周期的荧光信号用作荧光背景信号，荧光阈值是PCR 3-15个周期期间荧光信号的标准偏差的10倍，并设置了荧光阈值 在PCR扩增的指数阶段。 通常，每个仪器在使用前都有其荧光阈值。

4. CT值

CT值表示当荧光信号达到设定阈值时，每个PCR反应管都会发生的循环数。 从研究中，云顶国际·(中国)唯一官方网站知道每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数之间存在线性关系。 初始副本编号越多，CT值越小，反之亦然。 使用具有已知起始副本编号的标准，可以制作校准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，而纵坐标表示CT值。 因此，只要获得未知样品的CT值，就可以从标准曲线中计算样品的初始拷贝数。

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有几个指标可以判断放大曲线是否良好：

答：曲线的拐点很明显，尤其是低重分样品的指数相很明显，放大曲线的总体平行性很好，基线是平坦的，没有上升现象，并且低 - 级的指数相位 浓度样品放大曲线很明显。

B：曲线指数相的斜率与扩增效率成正比，斜率越大，放大效率越高。

C：标准的基线是平坦或略微降低的，没有明显的向上趋势。

D：每个管的扩增曲线的并行性很好，表明每个反应管的扩增效率相似。

5.熔化曲线
当PCR产物加热时，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解离，从而导致荧光强度降低。 当达到一定温度时，大量产品分离，导致荧光急剧降低。 使用此功能以及不同PCR产物的不同TM值使荧光信号迅速下降的温度也不同，这可能是识别PCR特异性的好方法。
6.熔化曲线（采用对数曲线）
以熔解曲线的对数形成峰值图，以更直观地显示产品片段的情况。 由于熔化温度是DNA片段的TM值，因此可以确定某些影响DNA片段TM值的参数，例如片段大小，GC含量等。通常，根据云顶国际·(中国)唯一官方网站的底漆设计原理，通常会说 放大产物的长度在80-300bp的范围内，熔化温度应在80°C和90°C之间。
答：如果在80°C和90°C之间只有一个主峰，则意味着荧光定量PCR是完美的。
B：如果主峰出现在80°C和90°C之间，并且杂质峰出现在80°C以下，则基本上考虑了引物二聚体。 这是一个不错的选择，试图提高退火温度解决。
C：如果主峰出现在80°C和90°C之间，并且当温度升高时出现流浪峰，则基本上考虑了DNA污染。 并且需要在实验的初始阶段去除DNA。
7.标准曲线线
将标准标准稀释至不同的浓度，并用作PCR反应的模板。 标准曲线以标准拷贝数的对数为横坐标，将测量的CT值作为纵坐标绘制。 量化未知样品时，可以根据未知样品的CT值从标准曲线获得样品的拷贝数。 标准曲线对于绝对定量非常重要。

第二部分。 常见问题

Q1：RT-PCR，QPCR，实时PCR和实时RT-PCR有什么区别？

A1：RT-PCR是逆转录PCR，它是聚合酶链反应的广泛使用的变体。 在RT-PCR中，将RNA链反转录为互补DNA，然后用作PCR通过PCR扩增DNA的模板。

实时PCR和QPCR是同一件事，两者都是实时定量PCR，这意味着PCR过程中的每个周期都有数据的实时记录。 这样，可以精确分析启动模板的数量。

尽管实时PCR和逆转录PCR似乎都可以缩写为RT-PCR，但国际公约是RT-PCR专门指的是逆转录PCR，而实时PCR通常被缩写为qPCR（量化实际真实的真实真实真实的真实PCR）  - 时间PCR）。

实时RT-PCR（RT-QPCR）是一种逆转录PCR，结合了荧光定量技术：从RNA到获得cDNA（RT）的首次逆转录，然后使用实时PCR进行定量分析（QPCR）。

Q2：为什么在80-300bp的范围内控制荧光定量PCR的放大产物片段的长度？

A2：每个基因序列的长度不同，其中一些是几个Kb和几百个BP。 但是，当云顶国际·(中国)唯一官方网站设计底漆时，云顶国际·(中国)唯一官方网站只需要要求产品的长度为80-300bp，而太短或太长不适合定量PCR检测。

产品片段太短，无法与引物二聚体区分开。 引物二聚体的长度约为30-40bp，当它小于80bp时，很难区分它是引物二聚体还是产品。 如果产品片段太长，超过300bp，这很容易导致放大效率较低，并且无法有效检测基因的量。

例如，当您计算教室里的人数时，您只需要计算有多少个嘴巴即可。 检测基因时也是如此。 您只需要检测一个基因的某个序列即可表示整个序列。 如果您既计算嘴巴的数量，又要计算鼻子，耳朵和眼镜的数量以计算人数，那么犯错很容易。

Q3：底漆设计的最佳长度是多少？

A3：一般而言，20-24bp范围内的底漆长度很好。 当然，云顶国际·(中国)唯一官方网站必须在设计底漆时注意底漆TM值，因为它与最佳退火温度有关。 经过大量实验，已经证明60℃是一个很好的TM值。 低退火温度很容易导致非特异性扩增，而高退火温度通常会导致放大效率低，放大曲线的晚期峰和延迟的CT值。

问题4：收集的样品量会影响实验结果吗？

A4：不。显然，收集的样品越多，提取的RNA越多，cDNA越多，目标片段就会越多。 对于绝对定量，要计算目标片段的拷贝数，收集的样品量肯定会影响实验结果。 例如，检测血液中丙型肝炎病毒HBV的是以一定量（1ml）的血液检测HBV含量。

对于科学研究中通常使用的相对定量，样品的数量与实验结果无关，因为相对定量是指靶基因与参考基因之间的比较。 只是请认为它们是同一核酸链中存在的上游和下游片段。 如果样本量很大，则参考基因和靶基因均以同等比例同时增加，这不会影响结果。

Q5：逆转录酶的效率会影响实验结果吗？

A5：与上面相同。 请注意，云顶国际·(中国)唯一官方网站希望获得更高的逆转录效率，但是云顶国际·(中国)唯一官方网站更渴望逆转录酶的逆转录效率相对稳定并获得均匀的结果。 这将是对主要公司逆转录套件的优化功能的测试。

问题6：TAQ酶的效率会影响实验结果吗？

 A6：TAQ酶的效率相对较大。 通常，需要热启动的taq酶，并且效率相对较高。 对于商业荧光定量试剂盒，每个制造商将根据自己的产品接近100％的产品来优化最佳状态的效率，如果效率太低，则无法获得实验结果。 对于不同公司的产品，这是质量的衡量标准。

问题7：荧光染料的量会影响实验结果吗？

A7：是的，会。 如果荧光染料太饱和，则会引起某些仪器的噪声干扰。 如果荧光染料未饱和，并且荧光值太低，则它将尽早进入高原相，并且放大曲线将是平坦的。 在荧光定量实验中，主要看到CT值，因此对于晚期扩增曲线而言，进入高原阶段并不重要，但是该图不够美丽。 如果您必须做出选择，则首先选择荧光染料稍微不饱和。 但是，当使用同一公司的同一产品时，其效果基本上可以忽略不计。

问题8：PCR管的透射会影响实验结果吗？

A8：是的。 但是，对于来自同一制造商的同一批消耗品，可以忽略这种效果。 这是一个不错的选择，最好使用带有高渗透性膜的96孔板来最大程度地减少消耗品的光透射率的影响。

Q9：操作期间的误差会影响实验结果吗？

A9：操作过程的影响主要反映在均匀性中。 均匀性意味着系统中的所有组件均匀混合在一起，瞬时离心可以解决此问题。 此外，对于初学者，最好将PCR系统调整为20英寸以上，而一个太小的系统更容易出现错误。 如果正确优化退火温度，则底漆浓度对CT的影响最小化。 而且您会知道，可以通过优化退火温度来避免一些操作错误（例如底漆浓度）。

总结

以上是新手在实验期间经常遇到的一些问题和疑问，云顶国际·(中国)唯一官方网站希望这些问题可以帮助您解决一些困惑。 实验是产生混乱和解决问题的过程，希望您能从中得到一些东西。 感谢您的阅读，云顶国际·(中国)唯一官方网站下次会见您！